mRNA疫苗有望开启新一轮技术革命，诺奖只是时间问题？
当地时间9月24日，有“诺奖风向标”之称的拉斯克奖（Lasker Award）公布了2021年获奖人名单，其中临床医学奖授予为新冠mRNA疫苗问世做出突出贡献的卡塔林·卡里科（Katalin Karikó）和德鲁·韦斯曼（Drew Weissman），此外，2位科学家还获得了科学突破奖等众多科学大奖。
mRNA疫苗技术也是今年诺贝尔奖的最大热门，尽管今年并未获奖，但其在新冠疫情防控中起到的重要作用不可忽视，且对今后的医疗健康产生了极大影响。
mRNA疫苗怎样在体内发挥作用？它的安全性如何？今后的发展方向是什么？这些都是我们所关注的话题。mRNA疫苗是一种通用度高、构建快、有效性高以及易于规模化生产的全新疫苗技术。
动物模型研究表明，mRNA疫苗能够诱导机体产生针对寨卡、埃博拉和HIV的免疫反应，针对癌症患者的研究亦表明，机体能对mRNA疫苗产生CD4+T和CD8+T细胞应答。
癌症患者可对mRNA疫苗产生
CD4+ T 和CD8+ T 细胞应答 来源：Science而用于预防的mRNA新冠疫苗BNY162和MRNA-1273也表现出现了优秀的安全性和有效性。
mRNA疫苗的免疫学特性
使用抗原编码mRNA的关键优势之一是可以唤起MHC-Ⅰ递呈并引起细胞毒性T细胞（CTL）反应。
mRNA可以在细胞质中瞬时表达和积聚抗原，这些抗原可以被高效地加工成多肽并装载在MHC-Ⅰ类通路中。因此，胞浆中存在少量的mRNA就可以确保广泛的抗原被递呈到CTL。
MHC-Ⅱ类通路也可以使用mRNA作为抗原的来源，如mRNA表达的蛋白分泌和循环后，或直接将抗原从细胞质穿梭到溶酶体，也可以在mRNA结构设计中定向溶酶体靶向序列。
来源：Molecular Therapy
21世纪初，mRNA传递被证明可触发树突状细胞（DCs）的抗病毒激活状态，可能与核内体的清道夫受体7（TLR7）和TLR8识别单链RNA有关。
通过形成RNA二级结构或在IVT mRNA生成过程中引入双链（ds）RNA片段污染物，免疫激活可通过核内体的TLR3途径激发；除了TLRs，dsRNA还被证明可以激活胞质RNA传感器视黄酸诱导基因（RIG-Ⅰ）和黑色素瘤分化相关蛋白5（MDA5）。
mRNA分子结合这些危险信号传感器后将通过特定的适配分子（例如TLR7/8的MyD88分子和TLRS的TRIF）导致信号分子下调，最终将导致Ⅰ型干扰素和其他促炎因子（例如IL-6和TNF-α）产生。
相反，Ⅰ型干扰素结合自分泌和旁分泌受体，激活Janus激酶信号转导转录激活因子（JAK-STAT）通路，该通路调节了数百种参与抗病毒免疫蛋白的基因表达。
来源：Journal of Autoimmunity
这些信号通路协调不同的先天和适应性免疫反应的激活和促进，也被称为mRNA的“自佐剂效应”。
mRNA疫苗的分子设计原理
体外转录mRNA的基本结构与真核mRNA非常相似，包括：一个蛋白编码的开放阅读框（ORF）、两侧的5’和3’非翻译区、5’末端的7-甲基鸟苷帽子结构、3’端100-250bp的poly(A)尾巴。
非编码结构特征在mRNA的药理作用中起着重要作用，可以单独优化以提高mRNA的稳定性、翻译效率和免疫原性。
mRNA中核苷酸类似物的设计
研究发现，在体外转录的mRNA中用假尿苷替代鸟苷可以降低2'-5'-寡腺苷酸合成酶的活性，后者可通过RNaseL酶调节mRNA的切割，同时与mRNA翻译过程抑制相关的蛋白激酶R活性降低。
在实际治疗应用中，Kormann等证明，相比于未修饰的mRNA相比，核苷修饰后mRNA编码的促红细胞生成素（EPO）在给药两周后水平升高了5倍。
核苷修饰后mRNA编码的EPO变化
来源：Nature Biotechnology使用核苷类似物合成转录产物的大部分TLR都不再被激活，mRNA翻译效率增加的同时免疫原性降低，稳定性升高的同时免疫原性降低。
5'UTRs和3'UTRs的设计
除了加入修饰的核苷酸外，还可以通过多种方式增加mRNA的翻译能力和稳定性。
通过优化mRNA的ORF和UTR序列，如丰富GC含量，选择长寿mRNA分子的UTR，均可强化mRNA的表达。
来源：Nature Biotechnology
已有研究表明，5'UTR区域短而松散的结构可能有利于核糖体结合起始编码复合物的形成。
最近的一项研究发现了几个新的3'UTR序列，与人类β-珠蛋白3'UTR的基准相比，这些序列可以诱导产生大约3倍的蛋白，并且诱导了更有效的治疗效果。
Cap结构和Poly(A)尾的设计
mRNA的Cap结构与其稳定性密切相关，其通过与真核翻译起始的复合因子eIF4E结合从而调节mRNA翻译效率。
加帽后mRNA 5'端缺失末端游离磷酸基团，对碱性磷酸酶很稳定，且帽子结构能够封闭磷酸酯键上游离的2'OH基团，从而对部分RNA酶（T2、T1、A）很稳定。
抗反转帽（ARCA）修饰可以确保5'末端的正确定位，产生几乎完整的mRNA片段，从而有效地结合核糖体。
其他Cap修饰，如硫代磷酸cap类似物，可进一步提高与起始因子eIF4E的亲和力，并增加对RNA脱帽复合物的抗性。
酶加帽法（一种传统加Cap的方法）
来源：PNAS3'端Poly(A)尾是除了5'端Cap结构外对mRNA稳定性起重要作用的结构，mRNA的降解大多数是从Poly(A)尾端开始的，先将Poly(A)尾结构经脱腺苷化作用缩短为寡A尾巴，然后通过一系列的后续反应导致5'帽子结构被除去，从而被核糖核酸外切酶降解。
mRNA的Poly(A)尾的伸长与表达持续时间相关，3'UTR的特异性修饰可通过影响脱腺苷率而减缓Poly(A)尾的衰变。
据报道，Poly(A)尾长度的增加可能提高形成多聚体的几率，最适宜的Poly(A)尾长度位于120-150 bp之间。
mRNA疫苗的递送系统
mRNA疫苗原位靶向抗原提呈细胞（APCs）有许多点，但想要将mRNA成功地输送到靶细胞，还有不少具有挑战性的技术障碍需要克服。
尽管裸mRNA疫苗能够成功表达，但基于mRNA的纳米载体的也开始了研究，原因在于载体内的mRNA能更好地抵御酶的降解，使新的递送途径（如静脉注射）成为可能。
脂质纳米颗粒（LNPs）是目前最先进的递送系统，最初在siRNA的传递中证明是安全有效的，在最新的新冠疫苗大规模临床试验中，LNPs表现出了极为优秀的效果。
mRNA递送系统图示
来源：Biomaterials Science经mRNA递送测试的脂质配方通常由阳离子/离子化脂质和其他“辅助”脂质组成，如磷脂、胆固醇和/或聚乙二醇脂质。
阳离子类脂类一般用于负电荷mRNA分子的静电络合，辅助脂质因为其独特的功能特性可能会影响复杂的mRNA LNPs的结构排列，从而提高其稳定性和促进mRNA（LNPs）的细胞内摄取和胞质进入。
影响整体转染效率的关键困难之一是被吞没的mRNA LNPs的核内体降解，mRNA的核内体释放背后的机制被认为依赖于LNPs的质子化（“电离”）脂质和核内体膜的阴离子磷脂的混合步骤。
这些脂质之间的离子对的形成会引发膜融合和膜失稳，反过来增强了mRNA分子从核内体的逃逸。
另一种mRNA LNPs的产生策略是乙醇稀释，这是一种适合于制备技术上更先进的含电离性脂质LNP体系的方法。
乙醇稀释策略
来源：PNAS将单个脂质溶解在乙醇中，然后在酸性缓冲液中与mRNA快速混合。
通过稀释乙醇相，脂质进行缩合过程，形成LNPs的同时有效地包裹mRNA。
在随后的渗析步骤进行中和缓冲液，以除去乙醇并中和pH值。
通过调节不同脂质的摩尔比，研究发现了多种具有不同表面特征的mRNA LNPs，且有利于D-Lin-MC3-DMA脂质（pH依赖的电离性脂类）从内核到外表面部分分离的LNP组分与提高转染效率有关。
mRNA疫苗的安全性
mRNA疫苗除了拥有DNA疫苗胞内表达抗原的优点外，还克服了其免疫原性低、可能产生抗载体免疫、宿主DNA整合风险等缺点。
但随着研究的深入，发现mRNA疫苗的自佐剂效应可能带来潜在的安全性风险。
Ⅰ型IFNs参与免疫耐受调节，可促进自身反应性B细胞和T细胞的发育，对免疫系统构成一定的威胁。
在以往的临床试验中，出现了受试志愿者自身免疫反应诊断指标高达20%的报道，也出现了与自身免疫病有关的贝尔氏麻痹病例（一种暂时性面瘫）。
这种Ⅰ型IFNs信号在有效性和安全性方面的复杂性与mRNA疫苗的设计究竟有何关系还需要进一步的研究。
发展展望
可以预见，mRNA疫苗技术将是未来一种十分有潜力和优势的新型疾病治疗方式，并且随着mRNA疫苗技术的日趋成熟和完善，它将带来不可估量的应用价值和经济价值。
已有证据表明，mRNA疫苗的保护效果强于同种病毒的灭活疫苗、亚单位疫苗和病毒载体疫苗。
当前脂质纳米颗粒用于mRNA的局部和全身传递已成为一种趋势，但下一步需要透彻研究的点在于跨越细胞外和细胞内屏障的机制，以此能够有针对性地提高mRNA的整体转染能力。
尽管有自身免疫性面瘫的情况报道，但发生概率极低。
疫苗作为一个预防控制传染病的公共安全产品，最重要的属性是及时保护易感人群。
在遭遇突发新发传染病时，mRNA疫苗能做到最迅速的反应，从研发到生产的时间过程大大缩短，当mRNA的安全性和有限性指标能满足现有法规监管要求时，会是一种紧急使用的良好选择。
另外，mRNA疫苗大规模用于人体的时间太短，长期不良反应监测体系需要得到重视。
本文作者：马开利，张莹，李琦涵
作者简介：李琦涵，中国医学科学院、北京协和医学院医学生物学研究所，研究员，研究方向为病毒免疫学、分子生物学病毒疫苗开发及质量控制。
内容为【科技导报】新媒体原创，欢迎转载
白名单回复后台「转载」☟精彩内容回顾《科技导报》创刊于1980年，中国科协学术会刊，主要刊登科学前沿和技术热点领域突破性的成果报道、权威性的科学评论、引领性的高端综述，发表促进经济社会发展、完善科技管理、优化科研环境、培育科学文化、促进科技创新和科技成果转化的决策咨询建议。常设栏目有院士卷首语、智库观点、科技评论、热点专题、综述、论文、学术聚焦、科学人文等。
《科技导报》微信公众平台创建于2014年，主要刊登《科技导报》期刊内容要点，报道热点科技问题、科技事件、科学人物，打造与纸刊紧密联系又特色鲜明的新媒体平台。科技导报公众号聚集了数万名专心学术的未来之星和学术大咖，添加编辑微信，让优秀的你有机会与志趣相同的人相遇。